Цель работы.Цель работы. Изучение влияния активатора, окислителя и деблокирующего раствора на количественный выход олигонуклеотидов при производстве тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции «ГенХол».Материалы и методы.Материалы и методы. В качестве объекта исследований были выбраны праймеры ctx2 и ctx3, входящие в состав «Тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции «ГенХол». Для проведения исследований использовали экспериментальные составы растворов для деблокирования, активатора и окислителя и «стандартные» растворы, рекомендованные производителем ООО «Биоссет». Специфическую активность синтезированных праймеров ctx2 и ctx3 проверяли с использованием трех штаммов V. cholerae 569B, M-1298, 158 и E. coli 12226 О-55, готовили бактериальную суспензию возбудителей с конечной концентрацией 1·103 – 1·101 м.к./мл. ДНК выделяли методом нуклеосорбции в присутствии гуанидинизотиоцианата.Результаты и вывод.Результаты и вывод. Показана возможность оптимизации производства генодиагностических препаратов путем увеличения выхода олигонуклеотидов при фосфорамидитном синтезе за счет использования в качестве деблокирующего раствора 3 [%] дихлоруксусной кислоты в дихлорметане и окислителя – 0,1 М раствор йода в уксусной кислоте и пиридине в соотношении 1:9. Применение таких реагентов увеличивает выход конечного продукта (праймеров) на 6 и 95 [%] соответственно. Использование усовершенствованной технологии синтеза позволит снизить затраты на дорогостоящие импортные реагенты и повысить количество выпускаемых генодиагностических препаратов для детекции особо опасных патогенов.
А ралов А. В., Чахмахчева О. Г. Защитные группы в химическом синтезе олигорибонуклеотидов. Биоорг. химия. 2013; 39(1):3–25. DOI: 10.7868/S0132342313010028..
DOI: 10.7868/S0132342313010028
Г айдышев И. Анализ и обработка данных: специальный справочник. Санкт-Петербург: Питер; 2001. 752 с.
Beucage S.L., Caruthers M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites – A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Lett. 1981; 22(20):1859–62. DOI: 10.1016/S0040-4039(01)90461-7..
DOI: 10.1016/S0040-4039(01)90461-7
Ellington A., Pollard Jr. J.D. Current Protocols in Molecular Biology. Unit 2.11 Synthesis and Purification of Oligonucleotides. 1998. P. 2.11.1–2.11.25. DOI: 10.1002/0471142727.mb0211s42..
DOI: 10.1002/0471142727.mb0211s42
Ferretti L., Karnik S.S., Khorana H.G., Nassal M., Oprian D.D. Total synthesis of a gene for bovine rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83:599–603. DOI: 10.1073/pnas.83.3.599..
DOI: 10.1073/pnas.83.3.599
Kaplan B.E., Itakura K. 2-DNA Synthesis on Solid Supports and Automation. In: Synthesis and Applications of DNA and RNA. Academic Press; 1987. P. 9–45. DOI: 10.1016/B978-0-12-514030- 0.50007-4..
DOI: 10.1016/B978-0-12-514030- 0.50007-4
Kaplan B.E., Itakura K. 2-DNA Synthesis on Solid Supports and Automation. In: Synthesis and Applications of DNA and RNA. Academic Press; 1987. P. 9–45. DOI: 10.1016/B978-0-12-514030- 0.50007-4..
DOI: 10.1016/B978-0-12-514030-0.50007-4
Song F., Krull U.J. Selectivity of hybridization controlled by the density of solid phase synthesized DNA probes on glass substrates. In: Optical waveguide sensing and imaging. Springer Science and Business Media; 2008. P. 195–210. DOI: 10.1007/978-1-4020- 6952-9_8..
DOI: 10.1007/978-1-4020- 6952-9_8
Song F., Krull U.J. Selectivity of hybridization controlled by the density of solid phase synthesized DNA probes on glass substrates. In: Optical waveguide sensing and imaging. Springer Science and Business Media; 2008. P. 195–210. DOI: 10.1007/978-1-4020- 6952-9_8..
DOI: 10.1007/978-1-4020-6952-9_8
Wang C., Trau D. A portable generic DNA bioassay system based on in situ oligonucleotide synthesis and hybridization detection. Biosens. Bioelectron. 2011; 26(5):2436–41. DOI: 10.1016/j.bios.2010.10.028..
DOI: 10.1016/j.bios.2010.10.028
White H.A. Manual Oligonucleotide Synthesis Using the Phosphoramidite Method. New Nucleic Acid Techniques. Methods Mol. Biol. 1988; 4:193–213. DOI: 10.1385/0-89603-127-6:193..
DOI: 10.1385/0-89603-127-6:193