РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ CTXA И TOXR VIBRIO CHOLERAE МЕТОДОМ ОТ-ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

СтатьяПРОБ ОСОБ ОПАС ИНФ. 2017; № 3: 53–57. DOI:10.21055/0370-1069-2017-3-53-57

Крицкий А.А.^[1]

Челдышова Н.Б.^[1]

Тучков И.В.^[1]

Смирнова Н.И.^[1]

^[1]Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Цель.Цель. Создание алгоритма оценки экспрессии структурных и регуляторных генов вирулентности Vibrio cholerae на модели генов ctxA и toxR, кодирующих и контролирующих биосинтез холерного токсина.Материалы и методы.Материалы и методы. В работе использовано 10 штаммов Vibrio choleraе классического и Эль Тор биоваров. Клонирование фрагментов генов проводили путем лигирования и трансформации. ОТ-ПЦР проводили на амплификаторах «БИС М112» и «Rotor-GeneQ». Обработку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения к прибору RotorGeneQ (Software 1.8.17.5).Результаты и выводы.Результаты и выводы. Разработан алгоритм оценки уровня экспрессии генов ctxА и toxR V. cholerae методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Указанный алгоритм позволяет быстро и эффективно проводить статистически значимое определение экспрессии структурных и регуляторных генов вирулентности V. cholerae и может быть использован для оценки вновь выделяемых штаммов холерного вибриона.

V. cholerae

холерный токсин

гены ctxА и toxR

ОТ-ПЦР

уровень экспрессии

Алгоритмы

Вирулентность

Время

Гена регуляторные цепи

Генная экспрессия

Гены

Иммуноферментный твердофазный анализ

Лигирование

Методы

Оборудование, аппаратура, инструменты

Плазмиды

Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой

Программное обеспечение

Работа

Российская Федерация

Торий

Холера

Холерные вибрионы

Холерный токсин

Эукариоты

Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Заднова С.П., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические особенности штаммов Vibrio cholerae classica, вызвавших эпидемию азиатской холеры в России в 1942 г. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2001; 4:12–6.

Creating Standard Curves with genomic DNA or plasmid DNA templates for use in quantitative PCR. Applied Biosystems; 2003.

Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2–ΔΔCt Method. Methods. 2001; 25(4):402–8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262..
DOI: 10.1006/meth.2001.1262

Malinen E., Kassinen A., Rinttila Т., Palva A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 2003; 149(Pt 1):269–77. DOI: 10.1099/mic.0.25975-0..
DOI: 10.1099/mic.0.25975-0

Marashi S.M., Bakhshi B., Fooladi A.A., Tavakoli A., Sharifnia A., Pourshafie M.R. Quantitative expression of cholera toxin mRNA in Vibrio cholerae isolates with different CTX cassette arrangements. J. Med. Microbiol. 2012; 61(Pt 8):1071–3. DOI: 10.1099/jmm.0.038752-0..
DOI: 10.1099/jmm.0.038752-0

Matson J.S., Withey J.H., DiRita V.J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression. Infect. Immun. 2007; 75(12):554–29. DOI: 10.1128/IAI.01094-07..
DOI: 10.1128/IAI.01094-07

Muller P.Y., Janovjak H., Miserez A.R., Dobbie Z. Processing of gene expression data generated by quantitative Real-Time RTPCR. Biotechniques. 2002; 32(6):1372–9.

Palmer S., Wiegand A.P., Maldarelli F., Bazmi H., Mican J.M., Polis М., Dewar R.L., Planta A., Liu S., Metcalf J.A., Mellors J.W., Coffin J.M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(10):4531–6.

Sharkey F.H., Banat I.M., Marchant R. Detection and quantification of gene expression in environmental bacteriology. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70(7):3795–806. DOI: 10.1128/AEM.70.7.3795–3806.2004..
DOI: 10.1128/AEM.70.7.3795–3806.2004

Smith C.J., Osborn A.M. Advantages and limitations of quantitative PCR(Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 2009; 67(1):6–20. DOI: 10.1111/j.15746941.2008.00629.x..
DOI: 10.1111/j.15746941.2008.00629.x

Smith C.J., Osborn A.M. Advantages and limitations of quantitative PCR(Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 2009; 67(1):6–20. DOI: 10.1111/j.15746941.2008.00629.x..
DOI: 10.1111/j.1574-6941.2008.00629.x

Wang Т., Brown M.J. mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection. Anal. Biochem. 1999; 269(1):198–201. DOI: 10.1006/abio.1999.4022..
DOI: 10.1006/abio.1999.4022

Fykse E.M., Skogan G., Davies W., Olsen J.S., Blatny J.M. Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequence-based amplification. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73(5):1457–66. DOI: 10.1128/AEM.01635-06..
DOI: 10.1128/AEM.01635-06

Язык текста: Русский

ISSN: 0370-1069