Целью работы явилось клонирование гена nanH Vibrio cholerae в составе плазмидного вектора, обеспечивающего экспрессию чужеродных генов под контролем т5-промотора, и создание штамма E. coli – продуцента рекомбинантной нейраминидазы.
Материалы и методы. Донором ДНК послужил штамм V. cholerae о1, векторной плазмидой – pQE30. Ген амплифицировали с помощью пцр, клонирование осуществляли общепринятыми методами, продуктивность рекомбинантов и локализацию искомого белка определяли по результатам электрофореза лизатов клеток. Нейраминидазную активность определяли по наличию флуоресценции в ультрафиолетовом свете после инкубации со специфическим субстратом (4-метилумбеллиферил-N-ацетилнейраминовой кислотой). результаты и обсуждение. Сконструирована рекомбинантная плазмида pNanH, содержащая ген nanH V. cholerae, встроенный по сайтам BamHI-PstI в полилинкер pQE30. Экспрессия клонированного гена в штамме-продуценте E. Сoli JM103pNanH происходит под контролем т5-промотора при индукции изопропил-β-D-тиогалактозидом (иптг). Штамм обладает нейраминидазной активностью. рекомбинантный белок NanH накапливается в клетках продуцента в двух формах. первая, с молекулярной массой (мм) 89,5 кда, представляет собой непроцессированный белок с гексагистидиновым блоком (6His-tag) на N-конце и находится в тельцах включения. Ее содержание составляет 5,6–6,6 [%] суммарных клеточных белков. вторая, с мм 83 кда, обнаруживается в периплазматическом пространстве клеток и соответствует зрелой NanH, содержание составляет 3,4–3,8 [%]. Их общее содержание – 9–10 [%] суммарных клеточных белков, что позволяет считать штамм E. coli JM103pNanH суперпродуцентом искомого фактора. Штамм может быть использован для получения NanH V. cholerae в целях создания специфических диагностических, терапевтических и фармацевтических препаратов, а также для изучения свойств этого белка как фактора патогенности/персистенции возбудителя.
Galen J.E., Ketley J.M., Fasano A., Richardson S.N., Wasserman S.S., Kaper J.B. Role of Vibrio cholerae neuraminidase in the function of cholera toxin. Infect. Immun. 1992; 60(2):406–15. PMID: 1730470. PMCID: PMC257643.
Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates. Microbiology. 2002; 148(Pt 11):3681–93. DOI: 10.1099/00221287-148-11-3681..
DOI: 10.1099/00221287-148-11-3681
Figueiredo S.C., Neves-Borges A.C., Coelho A. The neuraminidase gene is present in the non-toxigenic Vibrio chol- erae Amazonia strain: a different allele in comparison to the pan- demic strains. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2005; 100(6):563–9. DOI: 10.1590/S0074-02762005000600010..
DOI: 10.1590/S0074-02762005000600010
Eneva R.T., Engibarov S.A., Petrova P., Abrashev R., Strateva T., Kolyovska V., Abrashev J. High production of neuraminidase by a Vibrio cholerae non-O1 strain – the first possible alternative to toxi- genic producers. Appl. Biochem. Biotechnol. 2015; 176(2):412–27. DOI: 10.1007/s12010-015-1584-4..
DOI: 10.1007/s12010-015-1584-4
Diesner S.C., Bergmayr C., Wang X.Y., Heiden D., Exenberger S. Roth-Walter F., Starkl P., Ret D., Palischoll J., Gabor F., Untersmayr E. Characterisation of Vibrio cholerae neuramini- dase as an immunomodulator for novel formulation of oral allergy immunotherapy. Clin. Immunol. 2018; 192:30–9. DOI: 10.1016/j.clim.2018.03.017..
DOI: 10.1016/j.clim.2018.03.017
Mountney A., Zahner M.R., Lorenzini I., Oudega M., Schramm L.P., Schnaar R.L. Sialidase enhances recovery from spinal cord contusion injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107(25):11561–6. DOI: 10.1073/pnas.1006683107..
DOI: 10.1073/pnas.1006683107
Mountney A., Zahner M.R., Sturgill E.R., Riley C.J., Aston J.W., Oudega M., Schramm L.P., Hurtado A., Schnaar R.L. Sialidase, chondroitinase ABC, and combination therapy after spinal cord con- tusion injury. J. Neurotrauma. 2013; 30(3):181–90. DOI: 10.1089/neu.2012.2353..
DOI: 10.1089/neu.2012.2353
Taylor G., Vimr E., Garman E., Laver G. Purification, crys- tallization and preliminary crystallografic study of neuraminidase from Vibrio cholerae and Salmonella typhimurium LT2. J. Mol. Biol. 1992; 226(4):1287–90. PMID: 1518058.
МишанькинБ.Н., ШиманюкН.Я., РябухинаО.Ю., Власов В.П. Штамм E. coli HB101 pRD39 – продуцент нейраминидазы холерного вибриона. Авторское свидетельство № 1210278 от 08.10.1985 г., опубл. 23.02.1987, Бюл. № 7.
Vimr E.R., Lawrisuk L., Galen J., Kaper J.B. Cloning and expression of the Vibrio cholerae neuraminidase gene nanH in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1988; 170(4):1495–504.
Moustafa I., Connaris H., Taylor M., Zaitsev V., Wilson J.C., Kiefel M.J., von Itzstein M., Taylor G. Sialic acid recognition by Vibrio cholerae neuraminidase. J. Biol. Chem. 2004; 279(39):40819– 26. DOI: 10.1074/jbc.M404965200..
DOI: 10.1074/jbc.M404965200
Монахова Е.В., Писанов Р.В., Гончарова Л.А., Михась Н.К., Непомнящая Н.Б., Асеева Л.Е., Каграманов В.С. Клонирование и экспрессия гена гемагглютинин/протеазы (hapA) Vibrio cholerae в Escherichia coli. Биотехнология. 2006; 6:8–15.
Рябухина О.Ю., Шиманюк Н.Я., Мишанькин Б.Н. Определение нейраминидазы у вибрионов О1 и не О1 групп. Лабораторное дело. 1990; (8):63–5.
Монахова Е.В., Писанов Р.В, Демидова Г.В., Непомнящая Н.Б. Штамм Escherichia coli – суперпродуцент ге- молизина Vibrio cholerae. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; 1:90–3. DOI: 10.21055/0370-1069-2018-1-90-93..
DOI: 10.21055/0370-1069-2018-1-90-93