Актуальность. Экзосомы относятся к классу внеклеточных везикул, которые секретируются клетками и циркулируют в биологических жидкостях, опосредуя межклеточную коммуникацию и передачу сигналов в различных патологических процессах, в том числе в модуляции развития раковых опухолей и опухолевого микроокружения. Клетки раковых опухолей продуцируют повышенное количество экзосом уже на начальных стадиях заболевания. Причем характерные для опухоли белковые маркеры могут встречаться в составе генерируемых экзосом, что делает последние перспективным объектом для детекции заболевания методом жидкостной биопсии. Основным препятствием для внедрения экзосом как маркеров развития заболеваний является отсутствие удобного, недорогого и быстрого метода для их выделения и детекции. Цель. Разработка платформы для выделения экзосом и детектирования белковых мембранных маркеров, изолированных экзосом. Материалы и методы. Разработаны магнитные наночастицы, функционализированные анти-EpCAM аптамером, для избирательного захвата субпопуляции экзосом опухолевых клеток. Эффективность магнитных наночастиц протестирована на экзосомах, полученных из EpCAM-позитивной линии клеток рака кишечника (HT29). Для обеспечения высокой чувствительности анализа экзосом из патологически измененных клеток, везикулы предварительно метили липофильным флуоресцентным красителем (3,3’диоктадецилоксакарбоцианин). Результаты. Показано, что магнитные наночастицы, связанные с аптамером анти-EpCAM, эффективно захватывали экзосомы из культуральной среды HT29. Методом проточной флуоресцентной цитометрии получен предел обнаружения порядка 107 экзосом/мл. Заключение. Настоящее исследование демонстрирует эффективный метод избирательного выделения экзосом от конкретного типа клеток, перспективный для современной диагностики и мониторинга онкологических заболеваний.
Thery C, Ostrowski M, Segura E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 2009;9(8):581–593. DOI: 10.1038/nri2567..
DOI: 10.1038/nri2567
Colombo M, Raposo G, Thery C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:255–289. DOI: 10.1146/annurevcellbio-101512-122326..
DOI: 10.1146/annurevcellbio-101512-122326
Ridder K, Keller S, Dams M, et al. Extracellular vesicle-mediated transfer of genetic information between the hematopoietic system and the brain in response to inflammation. PLoS Biol. 2014;12(6):e1001874. DOI: 10.1371/journal.pbio.1001874..
DOI: 10.1371/journal.pbio.1001874
Peinado H, Alečković M, Lavotshkin S, et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 2012;18(6):883–891. DOI: 10.1038/nm.2753..
DOI: 10.1038/nm.2753
Tenchov R, Sasso JM, Wang X, et al. Exosomes — nature’s lipid nanoparticles, a rising star in drug delivery and diagnostics. ACS Nano. 2022;16(11):17802–17846. DOI: 10.1021/acsnano.2c08764..
DOI: 10.1021/acsnano.2c08764
Yang L, Jia J, Li S. Advances in the application of exosomes identification using surface-enhanced Raman spectroscopy for the early detection of cancers. Front Bioeng Biotechnol. 2022;9:808933. DOI: 10.3389/fbioe.2021.808933..
DOI: 10.3389/fbioe.2021.808933
Melo SA, Luecke LB, Kahlert C, et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 2015;523(7559):177–182. DOI: 10.1038/nature14581..
DOI: 10.1038/nature14581
Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2013;2:20360. DOI: 10.3402/jev.v2i0.20360..
DOI: 10.3402/jev.v2i0.20360
Chen BY, Sung CWH, Chen C, et al. Advances in exosomes technology. Clin Chim Acta. 2019;493:14– 19. DOI: 10.1016/j.cca.2019.02.021..
DOI: 10.1016/j.cca.2019.02.021
Sunkara V, Park J, Han J, et al.Exosome precipitation by ionic strength modulation: ExoPRISM. ACS Appl Mater Interfaces. 2023;15(12):56807–56819. DOI: 10.1021/ acsami.3c12345..
DOI: 10.1021/ acsami.3c12345
Baranyai T, Herczeg K, Onódi Z, et al. Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS ONE. 2015;10(12):e0145686. DOI: 10.1371/journal.pone.0145686..
DOI: 10.1371/journal.pone.0145686
Yashchenok AM, Chernyshev VS, Konovalova EV, et al. Anti-CD63-oligonucleotide functionalized magnetic beads for the rapid isolation of small extracellular vesicles and detection of EpCAM and HER2 membrane receptors using DARPin probes. Anal Sens. 2023;3:e202200059. DOI: 10.1002/anse.202200059..
DOI: 10.1002/anse.202200059
Boriachek K, Islam MN, Gopalan V, et al. Quantum dot-based sensitive detection of disease specific exosome in serum. Analyst. 2017;142(12):2211–2219. DOI: 10.1039/C7AN00672A..
DOI: 10.1039/C7AN00672A
Chang M, Wang Q, Qin W, et al. Rational synthesis of aptamer-functionalized polyethylenimine-modified magnetic graphene oxide composites for highly efficient enrichment and comprehensive metabolomics analysis of exosomes. Anal Chem. 2020;92(22):15497–15505. DOI:10.1021/acs.analchem.0c03405..
DOI: 10.1021/acs.analchem.0c03405
Chen S, Shiesh SC, Lee GB, et al. Twostep magnetic bead-based (2MBB) techniques for immunocapture of extracellular vesicles and quantification of microRNAs for cardiovascular diseases: A pilot study. PLoS ONE. 2020;15(12):e0229610. DOI: 10.1371/journal.pone.0229610..
DOI: 10.1371/journal.pone.0229610
Li Q, Lv M, Lv L, et al. Identifying HER2 from serum-derived exosomes in advanced gastric cancer as a promising biomarker for assessing tissue HER2 status and predicting the efficacy of trastuzumab-based therapy. Cancer Med. 2023;12(4):4110–4124. DOI: 10.1002/cam4.5289..
DOI: 10.1002/cam4.5289
Runz S, Keller S, Rupp C, et al. Malignant ascitesderived exosomes of ovarian carcinoma patients contain CD24 and EpCAM. Gynecol Oncol. 2007;107(3):563–571. DOI: 10.1016/j.ygyno.2007.08.064..
DOI: 10.1016/j.ygyno.2007.08.064
Kawakami K, Fujita Y, Kato T, et al. Diagnostic potential of serum extracellular vesicles expressing prostatespecific membrane antigen in urologic malignancies. Sci Rep. 2021;11:15000. DOI: 10.1038/s41598-021-94532-7..
DOI: 10.1038/s41598-021-94532-7
Li W, Shao B, Liu C, et al. Noninvasive diagnosis and molecular phenotyping of breast cancer through microbead-assisted flow cytometry detection of tumorderived extracellular vesicles. Small Methods. 2018;2(10): 1800122. DOI: 10.1002/smtd.201800122..
DOI: 10.1002/smtd.201800122
Suárez H, Gámez-Valero A, Reyes R, et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semiquantitative analysis of extracellular vesicles. Sci Rep. 2017;7:11271. DOI: 10.1038/s41598-017-11264-3..
DOI: 10.1038/s41598-017-11264-3
Dose C, Huppert V, Kauling B, et al. Multisort cell separation method. US Patent 10,123,456, filed 15 March 2018, and issued 6 November 2018.
Diamandis EP, Christopoulos TK. The biotin- (strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin Chem. 1991;37(5):625– 636. DOI: 10.1093/clinchem/37.5.625..
DOI: 10.1093/clinchem/37.5.625
Hermanson GT. The reactions of bioconjugation. In: Bioconjugate Techniques. 3rd ed. Academic Press. 2013:229–258. ISBN: 978-0-12-382239-0.
Vashist SK, Lam E, Hrapovic S, et al. Immobilization of antibodies and enzymes on 3-aminopropyltriethoxysilane-functionalized bioanalytical platforms for biosensors and diagnostics. Chem Rev. 2014;114(21):11083–11130. DOI: 10.1021/cr5000943..
DOI: 10.1021/cr5000943
van Oss CJ, Giese RF, Bronson PM, et al. Macroscopic-scale surface properties of streptavidin and their influence on aspecific interactions between streptavidin and dissolved biopolymers. Colloids Surf B Biointerfaces. 2003;30(1–2):25–36. DOI: 10.1016/S0927-7765(03)00029-5..
DOI: 10.1016/S0927-7765(03)00029-5
Keller L, Werner S, Pantel K. Biology and clinical relevance of EpCAM. Cell Stress. 2019;3(6):165–180. DOI: 10.15698/cst2019.06.189..
DOI: 10.15698/cst2019.06.189
Unthank JL, Lash JM, Nixon JC, et al. Evaluation of carbocyanine-labeled erythrocytes for microvascular measurements. Microvasc Res. 1993;45(2):193–210. DOI: 10.1006/mvre.1993.1019..
DOI: 10.1006/mvre.1993.1019
Zou P, Chen H, Paholak HJ, et al. Noninvasive fluorescence resonance energy transfer imaging of in vivo premature drug release from polymeric nanoparticles. Mol Pharm. 2013;10(11):4185–4194. DOI: 10.1021/mp400502y..
DOI: 10.1021/mp400502y
Haugland RP. Antibody conjugates for cell biology. Curr Protoc Cell Biol. 2000;6:16.15.1–16.15.22. DOI: 10.1002/0471143030.cb1605s00..
DOI: 10.1002/0471143030.cb1605s00