Введение. Натрий-зависимый фосфатный транспортер NaPi2b – перспективная мишень для таргетной противоопухолевой терапии. его большой внеклеточный домен (ВКД) содержит скрытый эпитоп MX35, против которого разработаны терапевтические антитела, проходящие доклинические и клинические испытания. Доступность эпитопа MX35 для антител выше в опухолевых клетках и зависит от конформации ВКД, обусловленной дисульфидными связями между остатками цистеина С303, С322, С328 и С350. количество этих дисульфидных связей неизвестно, как и то, какие именно остатки цистеина участвуют в поддержании конформации ВКД NaPi2b, возможной регуляции его транспортной активности и стабильности. Выделение и очистка трансмембранных белков, включая NaPi2b, для структурных и функциональных исследований являются трудно разрешимыми задачами, поэтому необходимо разработать in vitro модель для изучения особенностей формирования дисульфидных связей в области ВКД транспортера NaPi2b, а также определения их роли в обеспечении доступности скрытого эпитопа MX35 и активности транспортера в живых клетках.Цель исследования – создание панели клональных сублиний карциномы яичника человека OVCAR-8, содержащих рекомбинантные варианты транспортера NaPi2b дикого типа, а также варианты с одиночными и двойными заменами остатков цистеина в области ВКД на остатки аланина.Материалы и методы. Клетки карциномы яичника OVCAR-8, не экспрессирующие ген транспортера NaPi2b, трансдуцировали лентивирусными частицами, несущими нуклеотидные последовательности, кодирующие транспортер NaPi2b дикого типа или его мутантные варианты с одиночными и двойными заменами остатков цистеина С303, С322, С328 и С350 на остатки аланина, для имитации восстановления потенциальных дисульфидных связей между ними. после отбора трансдуцированных клеток получали клональные сублинии, в лизатах которых методами вестерн- и дот-блоттинга оценивали содержание рекомбинантных вариантов транспортера NaPi2b. Результаты. Получена панель из 9 клональных сублиний карциномы яичника OVCAR-8, содержащих рекомбинантный транспортер NaPi2b дикого типа и его мутантные варианты. Отмечено влияние введенных аминокислотных замен на содержание и электрофоретическую подвижность транспортера NaPi2b. Заключение. Полученная панель клональных сублиний может быть использована в качестве in vitro модели для изучения конформации ВКД транспортера NaPi2b, обусловленной дисульфидными связями, что позволит раскрыть механизм образования скрытого эпитопа MX35 и пролить свет на роль ВКД в регуляции транспортной активности NaPi2b. понимание механизма образования скрытого эпитопа MX35 даст возможность найти новые скрытые эпитопы в составе внеклеточных доменов трансмембранных белков, которые могут быть использованы в качестве мишеней для таргетной противоопухолевой терапии.
Forster I.C. The molecular mechanism of SLC34 proteins: insights from two decades of transport assays and structure-function studies. Pflugers Arch European J Physiology 2019;471:15–42. DOI: 10.1007/s00424-018-2207-z.
DOI: 10.1007/s00424-018-2207-z
Murer H., Forster I., Biber J. The sodium phosphate cotransporter family SLC34. Pflugers Arch 2004;447:763–7. DOI: 10.1007/s00424-003-1072-5.
DOI: 10.1007/s00424-003-1072-5
Homann V., Rosin-Steiner S., Stratmann T. et al. Sodium-phosphate cotransporter in human salivary glands: molecular evidence for the involvement of NPT2b in acinar phosphate secretion and ductal phosphate reabsorption. Arch Oral Biol 2005;50(9):759–68. DOI: 10.1016/j.archoralbio.2005.01.009.
DOI: 10.1016/j.archoralbio.2005.01.009
Nishimura M., Naito S. Tissue-specific mRNA expression profiles of human solute carrier transporter superfamilies. Drug Metab Pharmacokinet 2008;23(1):22–44. DOI: 10.2133/dmpk.23.22.
DOI: 10.2133/dmpk.23.22
Kiyamova R., Shyian M., Lyzogubov V.V. et al. Immunohistochemical analysis of NaPi2b protein (MX35 antigen) expression and subcellular localization in human normal and cancer tissues. Exp Oncol 2011;33(3):157–61.
Rangel L.B.A., Sherman-Baust C.A., Wernyj R.P. et al. Characterization of novel human ovarian cancer-specific transcripts (HOSTs) identified by serial analysis of gene expression. Oncogene 2003;22(46):7225–32. DOI: 10.1038/sj.onc.1207008.
DOI: 10.1038/sj.onc.1207008
Kopantzev E.P., Monastyrskaya G.S., Vinogradova T.V. et al. Differences in gene expression levels between early and later stages of human lung development are opposite to those between normal lung tissue and non-small lung cell carcinoma. Lung Cancer 2008;62(1):23–34. DOI: 10.1016/j.lungcan.2008.02.011.
DOI: 10.1016/j.lungcan.2008.02.011
Gryshkova V., Goncharuk I., Gurtovyy V. et al. The study of phosphate transporter NAPI2B expression in different histological types of epithelial ovarian cancer. Exp Oncol 2009;31(1):37–42.
Chen D.R., Chien S.Y., Kuo S.J. et al. SLC34A2 as a novel marker for diagnosis and targeted therapy of breast cancer. Anticancer Res 2010;30(10):4135–40.
Kim H.S., Kim D.H., Kim J.Y. et al. Microarray analysis of papillary thyroid cancers in korean. Korean J Intern Medicine 2010;25(4):399–407. DOI: 10.3904/kjim.2010.25.4.399.
DOI: 10.3904/kjim.2010.25.4.399
Shyian M., Gryshkova V., Kostianets O. et al. Quantitative analysis of SLC34A2 expression in different types of ovarian tumors. Exp Oncol 2011;33(2):94–8.
Soares I.C., Simões K., de Souza J.E. et al. In Silico analysis and immunohistochemical characterization of NaPi2b protein expression in ovarian carcinoma with monoclonal antibody Mx35. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2012;20(2):165–72. DOI: 10.1097/pai.0b013e318228e232.
DOI: 10.1097/pai.0b013e318228e232
Zhang Z., Ye S., Zhang M. et al. High expression of SLC34A2 is a favorable prognostic marker in lung adenocarcinoma patients. Tumor Biol 2017;39(7):1010428317720212. DOI: 10.1177/1010428317720212.
DOI: 10.1177/1010428317720212
Mattes M.J., Look K., Furukawa K. et al. Mouse monoclonal antibodies to human epithelial differentiation antigens expressed on the surface of ovarian carcinoma ascites cells. Cancer Res 1987;47(24 Pt 1):6741–50.
Yin B.W.T., Kiyamova R., Chua R. et al. Monoclonal antibody MX35 detects the membrane transporter NaPi2b (SLC34A2) in human carcinomas. Cancer Immun 2008;8:3.
Kiyamova R.G., Gryshkova V.S., Usenko V.S. et al. Identification of phosphate transporter Napi2b as MX35 cancer antigen by modified SEREX approach. Biopolym Cell 2008;24(3):218–24. DOI: 10.7124/bc.0007A3.
DOI: 10.7124/bc.0007A3
Kiyamova R., Gryshkova V., Ovcharenko G. et al. Development of monoclonal antibodies specific for the human sodium-dependent phosphate co-transporter NaPi2b. Hybridoma 2008;27(4):277–84. DOI: 10.1089/hyb.2008.0015.
DOI: 10.1089/hyb.2008.0015
Dos Santos M.L., Yeda F.P., Tsuruta L.R. et al. Rebmab200, a humanized monoclonal antibody targeting the sodium phosphate transporter NaPi2b displays strong immune mediated cytotoxicity against cancer: a novel reagent for targeted antibody therapy of cancer. PloS One 2013;8(7):e70332. DOI: 10.1371/journal.pone.0070332.
DOI: 10.1371/journal.pone.0070332
Fessler S., Dirksen A., Collins S.D. et al. XMT-1592, a site-specific dolasynthen-based NaPi2b-targeted antibody-drug conjugate for the treatment of ovarian cancer and lung adenocarcinoma. Cancer Res 2020;80(16_Suppl.):2894. DOI: 10.1158/1538-7445.am2020-2894.
DOI: 10.1158/1538-7445.am2020-2894
Bodyak N.D., Mosher R., Yurkovetskiy A.V. et al. the dolaflexin-based antibody-drug conjugate XMT-1536 targets the solid tumor lineage antigen SLC34A2/NaPi2b. Mol Cancer Ther 2021;20(5):896–905. DOI: 10.1158/1535-7163.mct-20-0183.
DOI: 10.1158/1535-7163.mct-20-0183
Kostianets O., Shyian M., Sergiy D. et al. Serological analysis of SEREX-defined medullary breast carcinoma-associated antigens. Cancer Invest 2012;30(7):519–27. DOI: 10.3109/07357907.2012.697231.
DOI: 10.3109/07357907.2012.697231
Garifulin O.M., Kykot V.O., Gridina N.Y. et al. Application of SEREX-analysis for identification of human colon cancer antigens. Exp Oncol 2015;37(3):173–80. DOI: 10.31768/2312-8852.2015.37(3):173-180.
DOI: 10.31768/2312-8852.2015.37(3):173-180
Kostianets O., Shyyan M., Antoniuk S.V. et al. Panel of SEREX-defined antigens for breast cancer autoantibodies profile detection. Biomarkers 2017;22(2):149–56. DOI: 10.1080/1354750X.2016.1252952.
DOI: 10.1080/1354750X.2016.1252952
Rubin S.C., Kostakoglu L., Divgi C. et al. Biodistribution and intraoperative evaluation of radiolabeled monoclonal antibody Mx35 in patients with epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol 1993;51(1):61–6. DOI: 10.1006/gyno.1993.1247.
DOI: 10.1006/gyno.1993.1247
Lindegren S., Andrade L.N.S., Bäck T. et al. Binding affinity, specificity and comparative biodistribution of the parental murine monoclonal antibody MX35 (Anti-NaPi2b) and its humanized version Rebmab200. PloS One 2015;10(5):e0126298. DOI: 10.1371/journal.pone.0126298.
DOI: 10.1371/journal.pone.0126298
Коротаева А.В., Булатова Л.Ф., Власенкова Р.А., Киямова Р.Г. Распознавание Na-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b моноклональными антителами в клетках бактерий и эукариот. Биотехнология 2022;38(5):66–72. DOI: 10.56304/S023427582205009X.
DOI: 10.56304/S023427582205009X
Kiyamova R., Minigulova L.F., Skripova V. et al. N-glycosylation status of membrane phosphate transporter NaPi2b is crucial for its epitope recognition by monoclonal antibody in tumour cells. Annals of Oncology 2020;31(Suppl. 5):S1227–8. DOI: 10.1016/j.annonc.2020.08.2193.
DOI: 10.1016/j.annonc.2020.08.2193
Булатова Л.Ф., Скрипова В.С., Коротаева А.В. и др. Распознавание мутантных форм натрий-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b моноклональными антителами в клетках рака яичника. Казанский медицинский журнал 2022;103(4):608–16. DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2022-608.
DOI: 10.17816/KMJ2022-608
Reshetnikova D., Bulatova L.F., Skripova V. et al. Effect of disulfide bonds and N-glycosylation on the recognition of the NaPi2b transporter by monoclonal antibodies. Annals of Oncology 2022;33(Suppl. 8):S1408. DOI: 10.1016/j.annonc.2022.09.082.
DOI: 10.1016/j.annonc.2022.09.082
Минигулова Л.Ф., Скрипова В.С., Нургалиева А.К. и др. Распознавание натрий-зависимого фосфатного транспортера NaPi2b моноклональными антителами N-NaPi2b в клетках карциномы яичника. Ученые записки Казанского университета 2020;162(4):529–40. DOI: 10.26907/2542-064X.2020.4.529-540.
DOI: 10.26907/2542-064X.2020.4.529-540
Firsova D., Levashov I., Reshetnikova D. et al. Analysis of the sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b expression in human tumor cell lines. EJCI 2022;52(S1):114–5. DOI: https://doi.org/10.1111/eci.13796.
DOI: 10.1111/eci.13796
Bulatova L.F., Skripova V.S., Nurgalieva A.K. et al. Structurally constrained tumor-specific epitope within the largest extracellular domain of sodium-dependent phosphate transporter NaPi2b. Ann Oncol 2021;32(5):S368–9. DOI: 10.1016/j.annonc.2021.08.304.
DOI: 10.1016/j.annonc.2021.08.304
Makhov P., Golovine K., Teper E. et al. Piperlongumine promotes autophagy via inhibition of Akt/mTOR signalling and mediates cancer cell death. Br J Cancer 2014;110(4):899–907. DOI: 10.1038/bjc.2013.810.
DOI: 10.1038/bjc.2013.810
Longo P.A., Kavran J.M., Kim M.S., Leahy D.J. Transient mammalian cell transfection with polyethylenimine (PEI). Methods Enzymol 2013;529:227–40. DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5.
DOI: 10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5
Boichuk S., Dunaev P., Skripova V. et al. Unraveling the mechanisms of sensitivity to anti-FGF therapies in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumors (GIST) lacking secondary KIT mutations. Cancers (Basel) 2023;15(22):5354. DOI: 10.3390/cancers15225354.
DOI: 10.3390/cancers15225354
Zavodszky M., Chen C.W., Huang J.K. et al. Disulfide bond effects on protein stability: designed variants of Cucurbita maxima trypsin inhibitor-V. Protein Sci 2001;10(1):149–60. DOI: 10.1110/ps.26801.
DOI: 10.1110/ps.26801
Karimi M., Ignasiak M.T., Chan B. et al. Reactivity of disulfide bonds is markedly affected by structure and environment: implications for protein modification and stability. Sci Rep 2016;6:38572. DOI: 10.1038/srep38572.
DOI: 10.1038/srep38572
Feige M.J., Braakman I., Hendershot L.M. Basic principles, cellular regulation and engineering. In: Oxidative folding of proteins. Ed. by M.J. Feige. The Royal Society of Chemistry, 2018. Pp. 1–33.
Bakshi T., Pham D., Kaur R., Sun B. Hidden relationships between N-glycosylation and disulfide bonds in individual proteins. Int J Mol Sci 2022;23(7):3742. DOI: 10.3390/ijms23073742.
DOI: 10.3390/ijms23073742